Fundamentos de Engenharia Genética

Tecnologia de DNA recombinante

Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, dando origem a uma molécula de DNA recombinante (DNAr).

Baseia-se na utilização de ferramentas moleculares como as enzimas de restrição, as ligases do DNA e os vectores.

Enzimas de restrição – reconhecem determinadas sequências de DNA e cortam a molécula nesses locais. As zonas de restrição correspondem a sequências de DNA curtas e simétricas que se lêem da mesma forma nas duas cadeias na direcção 5'-3'.

• As enzimas de restrição são bastante específicas e ocorrem naturalmente em bactérias. Protegem as bactérias dos ataques dos vírus, uma vez que reconhecem e cortam sequências específicas do DNA viral, inactivando-o. O DNA bacteriano está protegido da actividade das enzimas de restrição.


• A actividade das enzimas de restrição dá origem a fragmentos de DNA em dupla hélice – fragmentos de restrição - com extremidades em cadeia simples – extremidades coesivas.


• Verifica-se complementaridade de bases do DNA nas extremidades coesivas de diferentes fragmentos de restrição obtidos com a mesma enzima.
  

As extremidades coesivas emparelham através de ligações de hidrogénio entre bases complementares e podem unir-se pela actividade de ligases do DNA que catalizam a formação de ligações fosfodiéster.

Vector – entidade, constituída por DNA, que transfere o DNA de uma célula ou de um organismo dador para uma célula ou um organismo receptor.

• Os vectores mais utilizados são os plasmídeos e os bacteriófagos.
• Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que ocorrem naturalmente em algumas bactérias, leveduras e células vegetais.
• Os plasmídeos ligam-se a determinados compostos, tornando-os mais densos, permitindo a sua separação por centrifugação.

Processo de obtenção e expressão de uma molécula de DNAr:

1. Selecciona-se uma molécula de DNA dadora, contendo o gene com interesse que se pretende transferir e clonar, e um vector adequado.
2. A molécula de DNA e o vector são tratados com a mesma enzima de restrição, que corta as duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos.
3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vector e juntam-se ligases do DNA. O vector e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivas, que são complementares, e a ligase estabelece a ligação.
4. O vector, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula ou organismo receptor.
5. O DNA dador é incorporado no genoma da célula ou organismo receptor, que passa a possuir um DNA recombinante.
6. Um meio selectivo ou testes químicos permitem identificar as células que exprimem o gene desejado. No processo descrito formam-se fragmentos de restrição que não têm o gene desejado e nem todas as células receptoras incorporam o DNA dador.

Aplicações do DNA recombinante (DNAr):

• Investigação fundamental: torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular.
  
• Obtenção de OGM: os OGM são organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem características vantajosas.

Fonte: http://biohelp.blogs.sapo.pt/2575.html